人生就是博-尊龙凯时的细胞培养指南旨在为研究人员提供一个清晰的A549细胞系的培养条件和操作步骤。A549细胞系源自一名58岁白人男性肺癌患者，通过组织移植建立，能够通过胞苷二磷酸胆碱途径合成高含量不饱和脂肪酸的卵磷脂。

培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳；温度：37℃；培养基：F12K + 10% FBS + 1% P/S。

细胞传代

在第一次传代时，建议采用1:2的分瓶比例。应注意在细胞达到80%汇合度前，不进行传代。如果细胞密度超过80%，则可进行传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞是否大部分已转为圆形并脱落，随后迅速添加5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。

悬浮细胞传代

悬浮细胞的传代步骤分为半换液法与离心换液法：

1. 半换液法：垂直放置培养瓶静置1小时，轻轻吸取约3ml培养基，补充3ml完全培养基，如果培养基颜色变化缓慢，可以直接添加500ul左右FBS。
2. 离心换液法：收集细胞悬液至离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养基重悬后按1:2比例分至新T25瓶中。

细胞冻存

当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，进行冻存操作：

1. 弃去培养液，PBS清洗一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，随后轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，将细胞沉淀重悬于1ml雅吉生物无血清冻存液中，混匀后放入冻存管。
4. 冻存细胞应放入-80℃冰箱，至少存放24小时后再转入液氮罐。

细胞复苏

细胞复苏时，请注意佩戴防护面具，操作如下：

1. 从液氮中取出冻存管，快速置于37℃水浴中解冻，直到无结晶，随后用75%酒精擦拭管外壁。
2. 将细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，重悬细胞于5ml完全培养基并接种至T25培养瓶，放入37℃、5%CO2的培养箱中。
4. 第二天，换用新鲜培养基继续培养。

注意事项

在运输过程中，部分细胞可能会因贴壁不牢而脱落，如遇到这种情况，可将培养液收集并离心，然后添加适量胰酶进行处理，最终按上述步骤进行分瓶传代。遵循以上细胞培养和处理步骤，确保细胞的健康生长，正如人生就是博-尊龙凯时所倡导的科学研究精神。