细胞冻存是一种通过将细胞置于低温环境中，以降低其代谢活动，从而实现长期储存和保种的目的。这一过程对于后续实验或临床应用至关重要。细胞冻存通常遵循慢冻原则，缓慢降温有助于细胞逐步脱水，避免因大冰晶形成而对细胞造成损伤。

一、冻存原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢活动和酶活性几乎完全停止，而在-130℃以下，细胞的生存率达到最佳。液氮的使用能够实现细胞的长期保存。冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能够迅速穿透细胞膜，降低冰点并延缓冻存过程，还能提升细胞膜的通透性，增加细胞内离子浓度，从而减少冰晶的形成，达到保护细胞的目的。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液；
2. 用PBS冲洗细胞，加入胰酶进行消化（此步骤与细胞传代操作相同）；
3. 消化终止后，重悬细胞并转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟；
4. 弃去上清，加入预热的冻存液。细胞最佳冻存密度为5×10^6~1×10^7/ml，通常不得低于5×10^5/ml；
5. 分装后，拧紧冻存管盖并做好标记；
6. 将冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；
7. 最后，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液充分混匀并转移至离心管；
2. 1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀；
3. 用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10^6/ml，通常不得低于5×10^5/ml；
4. 完成分装后，拧紧冻存管盖并做好标记；
5. 将分装好的冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱中过夜；
6. 随后，将冻存管转移至液氮中长期保存。

注意事项

1. 在细胞培养、传代和冻存过程中，务必严格执行无菌操作。
2. 传代时应适度消化，消化时间受多种因素影响。需注意细胞形态，一旦观察到细胞质回缩或连接松散，要立即终止消化。
3. 传代应在细胞处于对数期且未达到汇合状态时进行。
4. 冻存液需提前配制，切勿直接将DMSO加入细胞悬液中。
5. 选择处于对数生长期、活力达90%以上且汇合度在80%-90%左右的细胞进行冻存，以确保状态最佳。冻存密度可根据细胞特性调整。
6. 程序冻存盒、细胞冻存液和完全培养基等试剂需恢复至室温后使用。
7. 冻存前切忌长时间消化、过大力度吹打、过高离心速率或过长离心时间，以免对细胞造成损伤。
8. 冻存管的盖子必须拧紧，以防止水浴复苏时的污染。
9. 细胞不得在-80℃冰箱中长期保存，放置时间不应超过3天。
10. 若液氮或冰箱距离细胞房较远，应将细胞放置于干冰或冰盒中运输至细胞房。

符合生物医疗标准的冻存操作不仅能够有效保护细胞，还能够为未来的实验和临床应用提供高品质的细胞资源。在这一过程中，我们始终坚持人生就是博-尊龙凯时的理念，确保每一步操作都严谨细致，以达到最佳的冻存效果。